Klotho e Fumo di sigaretta - Klotho and cigarette smoke

Nell’era moderna, il fumo di sigaretta è uno dei principali problemi di salute pubblica. L’Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS – World Health Organization, WHO) riporta che i fumatori nel mondo hanno superato il miliardo di individui. E’ stimato che nel 2030 circa 8 milioni di fumatori ogni anno morirà per cause correlate al fumo.¹ Le principali patologie correlate al fumo di sigaretta sono il cancro, le patologie cardiovascolari e polmonari.² 
È noto in letteratura che il fumo di sigaretta sia in grado di aumentare lo stress ossidativo, il quale a sua volta è causa della morte precoce delle cellule epiteliali polmonari e della distruzione dell’architettura alveolare. Queste alterazioni portano allo sviluppo di un quadro enfisematoso e ridotto flusso aereo polmonare.³  

E’ descritto, inoltre, che il fumo di sigaretta sia il principale fattore di rischio per sviluppare la Broncopneumopatia Cronica Ostruttiva (BPCO) che da ora in poi sarà chiamata con il termine inglese COPD (Chronic Obstructive Pulmonary Disease).⁴

Domanda: 
La proteina Klotho è influenzata dal fumo di sigaretta ed è in grado di attenuarne gli effetti nocivi?

Risposta breve: 
- Modelli sperimentali: SI 
- Uomo: SI, ma con alcuni studi discordanti

 

Approfondimento:

Uno studio⁵ condotto in vitro su cellule BEAS-2B, ha mostrato una riduzione delle specie reattive dell’ossigeno (ROS) nelle gruppo di cellule che over-esprimeva Klotho. I ROS erano incrementati dall’esposizione di fumo di sigaretta. Da qui il ragionamento: il fumo aumenta i ROS la cui concentrazione è ridotta nelle cellule che over-esprimono Klotho. Pertanto, Klotho contrasta gli effetti negativi del fumo. Ovviamente l’esposizione avveniva tramite specifica metodica anche perché nella pratica non è semplice far fumare delle cellule.

Anche lo studio di Qui e colleghi⁶ affronta gli effetti dell’estratto del fumo di sigaretta su cellule MH-S and 16HBE, le quali aumentano la metilazione del promotore del gene Klotho. Le cellule esposte al CSE aumentano l’espressione della DNA-metiltransferrasi e attivano il segnale Notch che favorisce la metilazione del promotore di Klotho. Risultato: la proteina Klotho è meno espressa. Risultato importante, tuttavia rimane uno studio in vitro.

Lo Studio di Gao e colleghi⁷ è una pietra miliare. È un articolo già discusso nel precedente post sulla COPD. La ricerca dimostra che l’espressione di Klotho è ridotta nei pazienti fumatori non-COPD nei confronti del gruppo controllo ed è ulteriormente ridotta (-65%) nei pazienti con COPD. È presente, inoltre, una differenza statisticamente significativa tra il gruppo dei fumatori non-COPD ed il gruppo COPD.

Lo studio⁸ successivo è correlato al precedente. Gli Autori sono più o meno gli stessi. È un approfondimento e mostra come l’espressione di Klotho sia modulata, in senso negativo, nei macrofagi alveolari esposti al fumo di sigaretta. I macrofagi sono stati isolati da pazienti non fumatori, fumatori non-COPD e COPD. Anche in questo caso, l’esposizione dei macrofagi avveniva tramite metodica specifica, esponendoli al CSE (cigarette smoke extract).

In stretta correlazione con quest’ultima Ricerca, se non da considerarsi il suo naturale proseguimento, è l’Articolo⁹ pubblicato dagli stessi Autori nel quale si approfondisce l’influenza di Klotho nei macrofagi alveolari esposti al CSE. In questa occasione è dimostrata la capacità della proteina Klotho di ridurre il processo di autofagia indotto dal CSE. L’inibizione è ottenuta impedendo la fosforilazione dell’IGF-1R, di Akt e di ERK.

Verde e colleghi¹⁰ pubblicano la loro ricerca che prevede l’arruolamento di fumatori definiti sani (healthy smokers). Definizione che mi è sempre apparsa un ossimoro. Tuttavia, i soggetti arruolati non presentavano patologie degne di nota, in particolare non avevano deficit respiratori e la funzionalità renale era conservata. Veniamo a Klotho. La concentrazione aumentava con l’aumentare dei n.pacchetti per anno (pack years smoked – PYS) e le sigarette fumate giornalmente (cigarettes per day – CPD). La concentrazione di Klotho, inoltre, era sorprendentemente aumentata nei soggetti forti fumatori (heavy smokers) rispetto al gruppo dei light smokers (<20 PYS). La spiegazione da parte degli Autori avviene citando lo studio di Nakanishi¹¹ (che vedremo successivamente) e ipotizzando che l’aumento di Klotho nel soggetto sano sia una risposta anti-ossidante all’esposizione del fumo di sigaretta il quale ènoto per incrementare lo stress ossidativo.

Giungiamo quindi a commentare il primo¹¹ dei due studi effettuati da Nakanishi. La ricerca dimostra un aumento significativo della concentrazione sierica di Klotho nei soggetti fumatori rispetto a soggetti sani. Riscontra inoltre una correlazione positiva tra concentrazione sierica di Klotho e interleuchina (IL)-6 nota citochina pro-infiammatoria. Questa correlazione, però, è presente solo negli uomini di mezza età non-fumatori. Nei soggetti fumatori la correlazione si perde. 
Il principale limite dello studio è l’arruolamento di solo soggetti maschi e, a differenza di altri studi, non abbiamo dati riguardanti le prove di funzionalità respiratoria. La definizione “in salute” dei soggetti arruolati è ottenuta tramite questionario. L’incremento di Klotho nei fumatori è spiegato come effetto compensativo allo stato infiammatorio indotto dal fumo di sigaretta. L’IL-6 correla solo nei non fumatori di mezza età, la mancanza dello stesso dato nei fumatori è, anche in questo caso, spiegato come effetto compensatorio.

Il secondo studio di Nakanishi e colleghi pubblicato nel 2018, analizza le concentrazioni sieriche anche nel genere femminile. Conferma l’incremento di Klotho sierico negli uomini fumatori rispetto i non-fumatori, ma non trova nessuna differenza tra le concentrazioni nelle fumatrici rispetto le non-fumatrici. Identifica così gli uomini come unici ad avere una possibile risposta anti-infiammatoria al fumo di sigaretta. Come lo studio precedente, sono dosante le concentrazioni di IL-6. A differenza dei precedenti risultati, viene correlata la concentrazione di IL-6 nei maschi non differenziando se fumatori o non-fumatori. Si riscontra una relazione positiva, dato non confermato nel gruppo femminile (non-fumatrici+fumatrici). 
Anche in questa Ricerca non sono vengono effettuate le prove di funzionalità respiratoria. Si definiscono tutti i soggetti come sani in quanto non assumono nessuna terapia in cronico e non riferiscono patologie acute nelle ultime due settimane. Criteri di selezione che possono essere ritenuti almeno in parte opinabili.

La ricerca di Kureya,¹² già discussa nel post della COPD, arruola soggetti sani, fumatori non-COPD e fumatori COPD. Tutti maschi giapponesi. Nessuno ha ricevuto terapia steroidea, concessa solo quella inalatoria LABA/LAMA. La concentrazione sierica di Klotho è maggiore nei pazienti fumatori non-COPD rispetto i sani. Conferma il dato già riscontrato nella maggior parte degli studi sopra riportati. Inoltre, i pazienti fumatori-COPD, presentano livelli più bassi rispetto agli altri due gruppi. Il Risultato potrebbe essere spiegato da una iniziale compenso da parte dell’organismo nell’incrementare Klotho per contrastare i processi infiammatori correlati al fumo che in una seconda fase più avanzata (fumatori-COPD) viene persa. Da far notare che a tutti i soggetti vengono effettuate le prove di funzionalità respiratoria e che nessun dato correla con la concentrazione sierica di Klotho.

A supportare, seguendo il processo inverso, gli studi riguardanti il dosaggio sierico di Klotho nei fumatori abbiamo la Ricerca di Kamizono.¹³ Il dosaggio avveniva nei pazienti arruolati precedentemente in un trial clinico finalizzato a dimostrare l’efficacia e la sicurezza di un nuovo farmaco per smettere di fumare, la Vareniclina. Il gruppo di controllo applicava il cerotto di nicotina. 
I valori sierici di Klotho erano significativamente più alti a Tempo 0 rispetto a 12 settimane in quei pazienti i quali effettivamente avevano realmente smesso di fumare. All’opposto non è stata riscontrata nessuna differenza nei soggetti che, nonostante la terapia, avevano continuato a fumare. Nessuna differenza significativa è stata riscontrata tra il gruppo Vareniclina e nicotina.

Uno studio¹⁴ del 2013 tuttavia genera confusione. È condotto su donne con infezione gestazionale. I dati raccolti trovano una correlazione negativa tra Klotho e fumo di sigaretta. La spiegazione che potremmo formulare è che sia un dato falsato dal contesto. È noto che Klotho risulta ridotta nei processi infiammatori, pertanto, dosarla durante un’infezione avremmo ugualmente valori ridotti/falsati anche in quei pazienti che dovrebbero avere dei valori in realtà incrementati. Da non sottovalutare che in questo studio sono arruolate, gioco forza, solo donne, mentre nelle altre Ricerche sopra riportate i soggetti inclusi negli studi sono principalmente uomini e che nello studio di Nakanishi del 2018 non è stata riscontrata nessuna differenza tra fumatrici e non-fumatrici.

Altro studio che crea confusione è quello di Patel e colleghi,¹⁵ il quale non trova differenze tra concentrazione sierica di Klotho (pg/ml) tra soggetti sani, pazienti fumatori non-COPD e pazienti COPD. Tuttavia, mantiene una correlazione con la forza di contrazione muscolare (quadricipide). 
La Ricerca indaga, inoltre, l’espressione di Klotho a livello muscolare e trova che la concentrazione di Klotho (pg/mg) è più bassa nei fumatori (vedi articolo, fig.1B) rispetto ai non fumatori indipendentemente che siano affetti da COPD. Nella fig.1C dell’Articolo, la concentrazione muscolare di Klotho è ridotta nei pazienti con COPD fumatori cronici rispetto a quelli con COPD ex-fumatori. Faccio notare che non sono stati arruolati nello Studio i pazienti che hanno assunto di recente corticosteroidi (<30gg).

Un terzo Studio¹⁶ in grado di ostacolare l’interpretazione dei dati, proviene da Ricercatori portoghesi i quali non hanno trovano nessuna differenza tra le concentrazioni sieriche di Klotho nel gruppo di soggetti sani, il gruppo con insufficienza renale cronica III e IV stadio fumatori e non fumatori e nei pazienti dializzati fumatori e non fumatori. Solo nel gruppo di Controllo si è osservata una concentrazione ridotta di FGF23. Anche in questa occasione non sono state eseguite le prove di funzionalità respiratoria e venivano esclusi quei pazienti che assumevano corticosteroidi.

Un quarto Studio¹⁷ condotto analizzando la popolazione arruolata e seguita per anni nel Centro Italia (Studio InCHIANTI) ha confermato l'assenza di relazione tra fumo di sigaretta e concentrazione plasmatica di Klotho (p= 0.09).

Una ricerca¹⁸ del 2018 e riportata nel post della COPD, è incentrata più sull’FGF23 e sull’attivazione della via alternativa FGF23/FGFR4/PLCg/NFAT. Per ragioni di forza maggiore sono indagati anche gli effetti di Klotho nel modulare la risposta infiammatoria. In particolare, si dimostra che FGF23 è elevato rispetto i controlli nei pazienti con COPD con malattia lieve-moderata, ma non nei pazienti con forma severa.
Il fumo di sigaretta associato con FGF23 incrementa la produzione di IL-1b nelle biopsie bronchiali di pazienti COPD.

Il fumo di sigaretta incrementa l’espressione di FGFR4 e riduce quella di Klotho, favorendo lo switch alla via FGF23/FGFR4/PLCg/NFAT. Infine, ma non meno importante, la somministrazione di Klotho riduce la produzione di IL-1b indotta dal fumo di sigaretta. È da considerarsi uno studio importante in quanto evidenzia come Klotho modula le alterazioni citochiniche nelle cellule esposte al fumo di tabacco.

Infine, ultimo articolo¹⁹ già discusso nel post della COPD e della fibrosi polmonare. Si parla del gene KLOTHO, rientra in un pool di geni analizzati nello studio e quale associazione esiste con l’asse SARS-CoV-2 COVID-19 ACE2-TMPRSS2-Furin-DPP4. Viene analizzato l’RNA estratto da pazienti non fumatori, fumatori, con COPD e affetti da fibrosi polmonare. Di fatto non si parla di relazione Klotho e fumo di sigaretta. KLOTHO è uno dei geni analizzati e viene riscontrata una ridotta espressione nei pazienti fumatori, COPD e con fibrosi polmonare. Riduzione che può essere indicativa di un processo di invecchiamento precoce.

  

Concludendo:

I dati in vitro dimostrato quasi senza alcun dubbio le proprietà anti-infiammatorie di Klotho in quei setting invece dove il fumo di sigaretta attiva cascate pro-infiammatorie. 
Nell’uomo la maggior parte dei risultati conclude che nei fumatori senza patologie polmonari fumo-relate, la concentrazione sierica di Klotho sia aumentata come effetto compensativo. Di contro nelle fasi più tardive, dove il danno ormai è irreversibile e in eccesso, i valori sieri di Klotho siano ridotti. Possibile conferma potrebbe derivare dallo studio di Gao e colleghi⁷ nel quale hanno osservato una progressiva riduzione dell’espressione nei fumatori e nei pazienti con COPD.

  

Se conoscete altri studi in merito fatemelo sapere, attendo vostri suggerimenti, a disposizione per dubbi e chiarimenti. Per maggiori approfondimenti specifici vi rimando alla lettura dei singoli articoli.

MEDLINE effettuata su Pubmed alla data di pubblicazione del post, parole chiave della ricerca: Klotho AND “smoke”; Klotho AND “cigarette”; Klotho AND “smoking”; Klotho AND “tobacco”.

CREDITS Photo by Ray Reyes on Unsplash

 

 Bibliografia:

1.             World Health Organization. WHO Global Report: Mortality Attributable To Tobacco. Who Glob. Rep. (2012).

2.             Jha, P. et al. 21st-Century Hazards of Smoking and Benefits of Cessation in the United States. N. Engl. J. Med. (2013) 

3.             Tuder, R. M. & Petrache, I. Pathogenesis of chronic obstructive pulmonary disease. Journal of Clinical Investigation (2012) 

4.             Barnes, P. J. Chronic obstructive pulmonary disease. in Genomic and Precision Medicine: Infectious and Inflammatory Disease (2019).

5.             Blake, D. J., Reese, C. M., Garcia, M., Dahlmann, E. A. & Dean, A. Soluble extracellular Klotho decreases sensitivity to cigarette smoke induced cell death in human lung epithelial cells. Toxicol Vitr. 29, 1647–1652 (2015).

6.             Qiu, J. et al. Notch promotes DNMT-mediated hypermethylation of Klotho leads to COPD-related inflammation. Exp Lung Res 44, 368–377 (2018).

7.             Gao, W. et al. Klotho expression is reduced in COPD airway epithelial cells: Effects on inflammation and oxidant injury. Clin. Sci. (2015)

8.             Li, L. et al. Klotho Reduction in Alveolar Macrophages Contributes to Cigarette Smoke Extract-induced Inflammation in Chronic Obstructive Pulmonary Disease. J Biol Chem 290, 27890–27900 (2015).

9.             Li, L. et al. Klotho Regulates Cigarette Smoke-Induced Autophagy: Implication in Pathogenesis of COPD. Lung (2017) 

10.           Verde, Z. et al. A Paradox: α-Klotho Levels and Smoking Intensity. Lung (2017)

11.           Nakanishi, K. et al. Klotho-related Molecules Upregulated by Smoking Habit in Apparently Healthy Men: A Cross-sectional Study. Sci. Rep. (2015)

12.           Kureya, Y. et al. Down-Regulation of Soluble α-Klotho is Associated with Reduction in Serum Irisin Levels in Chronic Obstructive Pulmonary Disease. Lung (2016)

13.           Kamizono, Y. et al. Impact of cigarette smoking cessation on plasma α-klotho levels. Med. (United States) (2018) 

14.           Lam-Rachlin, J. et al. Infection and smoking are associated with decreased plasma concentration of the anti-aging protein, alpha-klotho. J Perinat Med 41, 581–594 (2013).

15.           Patel, M. S. et al. Klotho and smoking--An interplay influencing the skeletal muscle function deficits that occur in COPD. Respir Med 113, 50–56 (2016).

16.           Santos, G. D. Dos, Elias, R. M., Dalboni, M. A., Silva, G. V. da & Moysés, R. M. A. Chronic kidney disease patients who smoke have higher serum phosphorus. J. Bras. Nefrol. (2019)

17.           Shardell, M. et al. Serum 25-Hydroxyvitamin D, Plasma Klotho, and Lower-Extremity Physical Performance Among Older Adults: Findings From the InCHIANTI Study. J Gerontol A Biol Sci Med Sci 70, 1156–1162 (2015).

18.          Krick, S. et al. Fibroblast growth factor 23 and Klotho contribute to airway inflammation. Eur Respir J 52, (2018).

19.           Maremanda, K. P., Sundar, I. K., Li, D. & Rahman, I. Age-Dependent Assessment of Genes Involved in Cellular Senescence, Telomere, and Mitochondrial Pathways in Human Lung Tissue of Smokers, COPD, and IPF: Associations With SARS-CoV-2 COVID-19 ACE2-TMPRSS2-Furin-DPP4 Axis. Front. Pharmacol. (2020)