Klotho e Tumore polmonare - Klotho and Lung Cancer

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Il tumore polmonare è una delle neoplasie con un’alta mortalità e morbidità.¹ Ad esempio, nel 2009, il tumore non a piccole cellule (NSCLC) possedeva una sopravvivenza media a 5 anni di circa del 10%.² Oltre all’età,² un secondo fattore di rischio è l’aumento plasmatico dei livelli di IGF-1 (Insulin Growth Factor-1)^3,4 dato confermato dalle successive ricerche di Dong⁵ e di Ma⁶ nelle quali l’inibizione del segnale IGF-1 era in grado di ridurre la crescita delle cellule tumorali polmonari.

La proteina Klotho è nota per contrastare la crescita tumorale,⁷ ad esempio inibendo il segnale insulina/IGF-1.⁸ A questo punto, non ci resta che porre le domande.

Domanda 1:

Klotho svolge un ruolo protettivo nelle neoplasie polmonari?

Risposta breve 1:

·       modelli sperimentali: SI

·       Uomo: SI

 

Domanda 2:

Klotho può essere usato come marcatore tumorale?

Risposta breve 2:

·       Immunoistochimica: SI

·       siero/plasma: NO, ma dati non del tutto sufficienti

Approfondimento:

Carcinoma polmonare non a piccole cellule (NSCLC - Non-small cell lung cancer)

Il primo studio⁹ risale al 2010. È uno studio in vitro su cellule A549 di NSCLC. Come gruppo di controllo sono impiegate cellule HEK-293. L’espressione di Klotho è ottenuta tramite una specifica metodica (impiegato un plasmide). Le cellule A549 che over-esprimono Klotho presentano una crescita rallentata e una percentuale di apoptosi maggiore. Il risultato è ottenuto tramite la riduzione della fosforilazione dell’IGF-1R e il riscontro di una ridotta espressione del gene bcl-2 (un gene anti-apoptosi).

Gli stessi Autori hanno pubblicato nei mesi successivi un Articolo¹⁰ nel quale sono impiegate sempre cellule A549 di NSCLC. Viene ipotizzato e confermato che l’aumento dell’espressione di Klotho possa agire in sinergia con l’aumento del sCD40L nel rallentare la crescita tumorale.

sCD40L appartiene alla famiglie del TNF (Tumor Necrosis Factor) ed è principalmente espresso sulla superficie dei linfociti T CD4 positivi.¹¹ CD40 è, invece, espresso su numerosi tipi di cellule (es. endoteliali, tumorali e linfociti B) e svolge un ruolo chiave nell’attivazione dei linfociti B.¹¹ L’interazione sCD40L-CD40 è in grado di inibire la crescita tumorale.^12,13

Il terzo Studio,¹⁴ condotto sempre dagli stessi Autori, esplora il ruolo di Klotho nell’inibire la crescita tumorale inibendo il segnale Wnt. È sempre uno studio in vitro, sono impiegate come nella prima Ricerca cellule A549 e si osserva una rallentata crescita e ridotta motilità in quel gruppo cellulare in cui veniva somministrato Klotho. Si riscontra inoltre una ridotta espressione citoplasmatica di Klotho nelle cellule A549 rispetto ai campioni ottenuti da tessuto polmonare sano.

Ulteriore Ricerca¹⁵ effettuata dal team di Chen e Wang dimostra la riduzione significativa dell’espressione di Klotho nelle cellule di NSCLC resistenti al cisplatino (A549-DDP e H460-DDP). La cascata del segnale coinvolta sembrerebbe PI3K/Akt che presenta una aumentata fosforilazione al diminuire dell’espressione di Klotho. Quest’ultima, inoltre, modulerebbe il rapporto tra Bax e bcl-2 favorendo l’apoptosi delle cellule tumorali. Inoltre, in modelli sperimentali (topi) di xenotrapianto tumorale, è stato confermato il rapporto inverso fosforilazione Akt e espressione di Klotho.

Un altro gruppo di ricercatori ha pubblicato, nel 2016, un Articolo¹⁶ nel quale veniva esplorata la possibile capacità di Klotho nel migliorare/ridurre la resistenza della cellule tumorali polmonari alla chemioterapia. Si tratta di uno studio in vitro condotto su cellule derivate dalle A549; per tale motivo questo commento è stato inserito nella sezione NSCLC. Sono impiegate cellule resistenti al cisplatino (A549-DDP) e resistenti al docetaxel (SPC-A-1-DTX). Klotho è ridotto nelle cellule resistenti ai chemioterapici e la sua aumentata espressione riduce la proliferazione delle cellule tumorali chemio-resistenti. Inoltre, quest’ultime sono rese tanto più sensibili agli agenti chemioterapici all’aumentare sia della concentrazione che del tempo di esposizione a Klotho.

Una ulteriore Ricerca¹⁷ affronta, tra gli obiettivi secondari, la possibile correlazione tra miR-10b (microRNA) e espressione di Klotho. Sono arruolati 30 pazienti con neoplasia polmonare benigna e 189 pazienti con NSCLC. Esiste una correlazione inversa tra espressione di miR-10b ed espressione di Klotho. Si riscontra inoltre un consensuale aumento dell’mRNA e della proteina E-caderina ed di miR-10b. L’espressione di quest’ultima era incrementata con una peggiore outcome, il silenziamento di miR-10b porta all’incremento dell’apoptosi e riduzione della proliferazione neoplastica.

Uno studio del 2018,¹⁸ ha mostrato la capacità di Klotho di ridurre lo stress ossidativo e il grado di senescenza dei fibroblasti polmonari dopo chemioterapia. Overespressione di Klotho inibiva l’attivazione del segnale STAT3 e riduceva la produzione di interleuchina (IL)-6 e IL-8 da parte dei fibroblasti polmonari. Gli Autori concludono, inoltre, che Klotho regola indirettamente la proliferazione delle cellule tumorali e la transizione EMT (vedi sotto, sezione “Carcinoma squamocellulare”) interferendo con la produzione di IL-6 e IL-8 da parte dei fibroblasti polmonari.
Da precisare che si tratta di uno studio in vitro dove sono linee celllulari HELF (Human embryonic lung fibroblast) e di adenocarcinoma umano (A549). La ricerca è stata condotta sempre dal team di Chen e il presente Studio, molto probabilmente, sarà ripreso in un futuro post riguardante Klotho e stress ossidativo.

Infine, una Ricerca¹⁹, sempre in vitro, pubblicata nel 2019 sempre dal team di Chen, ha riscontrato che la proteina Rab8 è in grado di modulare l’espressione di Klotho nel NSCLC. In particolare, Rab8 regola la modulazione indotta da Klotho del segnale Wnt. Questo si realizza modulando l’espressione di Klotho sulla superficie cellulare. L’incremento di Klotho sulla superficie porta alla riduzione della proliferazione, della migrazione e dell’invasività delle cellule di NSCLC.

 

Carcinoma a grandi cellule neuroendocrine (LNEC - large cell neuroendocrine carcinoma)

E’ un tipo di tumore considerato variante del carcinoma polmonare a grandi cellule.^20,21 E’ una neoplasia rara e rappresenta circa il 3% di tutti i tumori polmonari.²² Nei pazienti sottoposti ad asportazione chirurgica del tumore, la sopravvivenza a cinque anni arriva sino al 55%. Tuttavia, le recidive di malattia e la comparsa di metastasi si riscontrano a distanza di poco tempo dall’intervento chirurgico.²²

La prima ricerca²³ incentrata sui LNEC è focalizzata a trovare un marcatore che possa discriminare i pazienti ad alto e basso rischio di mortalità. Viene dimostrato, anche seppur su un numero esiguo di soggetti, che i pazienti nei quali Klotho era over-espresso (riscontro a livello citoplasmatico, 33% dei casi) avevano una sopravvivenza maggiore. L’invasione linfonodale stranamente non correlava con la sopravvivenza ed è spiegabile con il ridotto numero di soggetti arruolati. Tuttavia, è stato riscontrato nel gruppo di pazienti senza metastasi linfonodali, che i soggetti nei quali il tumore over-esprimeva Klotho possedeva anche una sopravvivenza nettamente e significativamente maggiore.

Alla luce dell’esiguo numero di soggetti arruolati, Brominska e colleghi²⁴ hanno voluto effettuare una Ricerca simile alla precedente sopra riportata. Il numero di soggetti rimane ridotto anche a causa della bassa incidenza del tumore.²⁵ Le analisi dimostrano che nei soggetti in cui il tumore esprimeva Klotho, si osservava una sopravvivenza maggiore rispetto al gruppo che non lo esprimeva. Risultato simile è riscontrato in quei pazienti con tumore Klotho+ e invasione neoplastica dei vasi o metastasi viscerali. 
Il numero di pazienti arruolati dovrebbe essere 48 (36 Kl+ e 12 Kl-), tuttavia nel testo non è chiaramente esplicitato il numero di soggetti inclusi nello studio.
Infine, collateralmente, si conferma che il coinvolgimento linfonodale si associa ad un outcome peggiore.
 

Carcinoma squamocellulare

Il team di Usuda ha ipotizzato un possibile ruolo della proteina Klotho nell’inibire la transizione da cellula epiteliale a cellula mesenchimale.²⁶
In inglese EMT, Epithelial-Mesenchymal Transition. È uno step importante e fondamentale durante il quale le cellule epiteliali perdono la loro polarizzazione e le proprietà di adesione cellula-cellula. L’abilità di infiltrare e migrare presso altri organi è una tipica caratteristica delle cellule neoplastiche che sono andate incontro al processo di EMT.^27,28
Vengono arruolati dieci pazienti con carcinoma squamocellulare in situ e 30 pazienti con la medesima neoplasia ma di tipo invasivo.
Riscontrano che l’espressione di Klotho è confermata come in altri studi a livello dell’epitelio bronchiale ed è espresso anche in tutti i pazienti con carcinoma in situ. Nella forma invasiva, solo il 13% dei casi conservavano l’espressione della proteina Klotho. Non è stata riscontrata una differenza statisticamente significativa, ma solo una tendenza, riguardo la mortalità. Lo studio prosegue indagando, in vitro, la capacità di Klotho nell’inibire la transizione EMT. È impiegata una linea cellulare di cellule di carcinoma squamocellulare umane denominate SQ5. L’overespressione di Klotho porta alla completa soppressione dell’N-caderina, un marcatore di transizione EMT.

 

Carcinoma polmonare a piccole cellule (SCLC – small cell lung cancer)

Nei pazienti affetti da SCLC, di norma, alla diagnosi sono già presenti delle metastasi linfonodali.²⁹ Risponde abbastanza bene alla chemioterapia con cisplatino,²⁹ tuttavia la sopravvivenza a 2 anni è scarsa, massimo del 20%.³⁰ A rendere la gestione dei paziente ardua è la discrepanza tra stadiazione clinica e stadiazione anatomo-patologica che solo in poco più della metà dei casi coincide.³¹

Successivamente allo Studio sui LNEC, Usuda e colleghi³⁰ indagano, con una ricerca retrospettiva, le proprietà anti-tumorali di Klotho nei pazienti con SCLC. Il risultato è sconcertante. Anche in questa occasione i pazienti nei quali il tumore esprimeva la proteina Klotho (60% dei casi) a livello citoplasmatico presentavano una maggiore e significativa sopravvivenza rispetto al gruppo Klotho-negativi. Come riferito anche dagli Autori, il numero di pazienti arruolati è esiguo e sono necessari ulteriori studi per confermare i dati della ricerca.

 

Miscellanea

La Ricerca³² pubblicata di recente, nel 2020, da parte della professoressa Pako arruola pazienti affetti da NSCLC (n.31, 16 adenocarcinoma e 15 carcinoma squamocellulare) e da SCLC (n.14). Lo Studio non trova nessuna differenza tra concentrazione plasmatica di Klotho nei pazienti versus soggetti sani. Neppure le varie sotto-analisi tra i differenti sottogruppi ha riscontrato una significatività. Fa inizialmente eccezione l’analisi ANOVA (one-way) che ha mostrato una differenza al limite della significatività (p=0.04) tra i diversi tipi di tumore polmonare. Tuttavia, il numero di pazienti arruolati è esiguo e la potenza dello studio è stata calcolata sull’obiettivo primario (tumore vs soggetti sani). Inoltre, nell’analisi post-hoc di Tukey tale significatività viene persa.

Gli Autori Concludono che il dosaggio sierico di Klotho non sia utile come marcatore tumorale nonostante in altri Studi (descritti in precedenza) le differenze di espressione riscontrate in alcuni tumori siano correlate con un outcome migliore.

 

Conclusione:

Le ricerche effettuate negli ultimi venti anni hanno mostrato come l’espressione di Klotho possa essere impiegata come markers prognostico. Tuttavia, sono esigui gli Studi effettuati sull’uomo caratterizzati dall’arruolamento di un ampio numero di soggetti. Altre Ricerche sono pertanto necessarie per confermare sia gli studi in vitro che in vivo. Per quanto riguarda la concentrazione sieri di Klotho, abbiamo a disposizione solo uno studio nel quale viene arruolato un numero esiguo di pazienti. I dati sono pertanto da prendere in considerazione come punto di partenza per ulteriori Ricerche più approfondite e su larga scala.

  

Se conoscete altri studi in merito fatemelo sapere, attendo vostri suggerimenti, a disposizione per dubbi e chiarimenti. Per maggiori approfondimenti specifici vi rimando alla lettura dei singoli articoli.

  

MEDLINE effettuata su Pubmed alla data di pubblicazione del post, parole chiave della ricerca: Klotho AND “lung cancer”; Kloto AND respiratory.

  

Bibliografia:

1.             Siegel, R. L., Miller, K. D. & Jemal, A. Cancer statistics, 2020. CA. Cancer J. Clin. (2020) doi:10.3322/caac.21590.

2.             Jemal, A. et al. Cancer Statistics, 2009. CA. Cancer J. Clin. (2009) doi:10.3322/caac.20006.

3.             Yu, H. et al. Plasma levels of insulin-like growth factor-I and lung cancer risk: A case-control analysis. J. Natl. Cancer Inst. (1999) doi:10.1093/jnci/91.2.151.

4.             Dziadziuszko, R., Camidge, D. R. & Hirsch, F. R. The insulin-like growth factor pathway in lung cancer. J. Thorac. Oncol. (2008) doi:10.1097/JTO.0b013e31818180f5.

5.             Dong, A. Q., Kong, M. J., Ma, Z. Y., Qian, J. F. & Xu, X. H. Down-regulation of IGF-IR using small, interfering, hairpin RNA (siRNA) inhibits growth of human lung cancer cell line A549 in vitro and in nude mice. Cell Biol. Int. (2007) doi:10.1016/j.cellbi.2006.11.017.

6.             Ma, Z., Dong, A., Kong, M. & Qian, J. Silencing of the type 1 insulin-like growth factor receptor increases the sensitivity to apoptosis and inhibits invasion in human lung adenocarcinoma A549 cells. Cell. Mol. Biol. Lett. (2007) doi:10.2478/s11658-007-0022-1.

7.             Zhou, X. & Wang, X. Klotho: a novel biomarker for cancer. J Cancer Res Clin Oncol 141, 961–969 (2015).

8.             Xuan, N. T. & Hai, N. V. Changes in expression of klotho affect physiological processes, diseases, and cancer. Iran J Basic Med Sci 21, 3–8 (2018).

9.             Chen, B., Wang, X., Zhao, W. & Wu, J. Klotho inhibits growth and promotes apoptosis in human lung cancer cell line A549. J Exp Clin Cancer Res 29, 99 (2010).

10.           Wang, X. et al. Combined effects of klotho and soluble CD40 ligand on A549 lung cancer cells. Oncol Rep 25, 1465–1472 (2011).

11.           Von Bergwelt-Baildon, M. S. et al. Human primary and memory cytotoxic T lymphocyte responses are efficiently induced by means of CD40-activated B cells as antigen-presenting cells: Potential for clinical application. Blood (2002) doi:10.1182/blood.V99.9.3319.

12.           Noguchi, M. et al. Induction of antitumor immunity by transduction of CD40 ligand gene and interferon-γ gene into lung cancer. Cancer Gene Ther. (2001) doi:10.1038/sj.cgt.7700320.

13.           Georgopoulos, N. T. et al. A novel mechanism of CD40-induced apoptosis of carcinoma cells involving TRAF3 and JNK/AP-1 activation. Cell Death Differ. (2006) doi:10.1038/sj.cdd.4401859.

14.           Chen, B., Ma, X., Liu, S., Zhao, W. & Wu, J. Inhibition of lung cancer cells growth, motility and induction of apoptosis by Klotho, a novel secreted Wnt antagonist, in a dose-dependent manner. Cancer Biol Ther 13, 1221–1228 (2012).

15.           Wang, Y. et al. Klotho Sensitizes Human Lung Cancer Cell Line to Cisplatin via PI3k/Akt Pathway. PLoS One (2013) doi:10.1371/journal.pone.0057391.

16.           Chen, T. et al. Decreased Level of Klotho Contributes to Drug Resistance in Lung Cancer Cells: Involving in Klotho-Mediated Cell Autophagy. DNA Cell Biol 35, 751–757 (2016).

17.           Huang, J., Sun, C., Wang, S., He, Q. & Li, D. microRNA miR-10b inhibition reduces cell proliferation and promotes apoptosis in non-small cell lung cancer (NSCLC) cells. Mol. Biosyst. (2015) doi:10.1039/c4mb00752b.

18.           Chen, B. et al. Overexpression of Klotho Inhibits HELF Fibroblasts SASP-related Protumoral Effects on Non-small Cell Lung Cancer Cells. J Cancer 9, 1248–1258 (2018).

19.           Chen, B. et al. Rab8 GTPase regulates Klotho-mediated inhibition of cell growth and progression by directly modulating its surface expression in human non-small cell lung cancer. EBioMedicine (2019) doi:10.1016/j.ebiom.2019.10.040.

20.           Travis, W. D. et al. Neuroendocrine tumors of the lung with proposed criteria for large-cell neuroendocrine carcinoma: An ultrastructural, immunohistochemical, and flow cytometric study of 35 cases. Am. J. Surg. Pathol. (1991) doi:10.1097/00000478-199106000-00003.

21.           Travis, W. D., Colby, T. V., Corrin, B., Shimosato, Y. & Brambilla, E. Histological Typing of Lung and Pleural Tumours. Histological Typing of Lung and Pleural Tumours (1999). doi:10.1007/978-3-642-60049-4.

22.           Filosso, P. L. et al. Multidisciplinary management of advanced lung neuroendocrine tumors. Journal of Thoracic Disease (2015) doi:10.3978/j.issn.2072-1439.2015.04.20.

23.           Usuda, J. et al. Klotho is a novel biomarker for good survival in resected large cell neuroendocrine carcinoma of the lung. Lung Cancer 72, 355–359 (2011).

24.           Brominska, B. et al. Klotho expression and nodal involvement as predictive factors for large cell lung carcinoma. Arch. Med. Sci. (2019) doi:10.5114/aoms.2018.75889.

25.           Gollard, R., Jhatakia, S., Elliott, M. & Kosty, M. Large cell/neuroendocrine carcinoma. Lung Cancer (2010) doi:10.1016/j.lungcan.2009.12.011.

26.           Ibi, T., Usuda, J., Inoue, T., Sato, A. & Takegahara, K. Klotho expression is correlated to molecules associated with epithelial-mesenchymal transition in lung squamous cell carcinoma. Oncol Lett 14, 5526–5532 (2017).

27.           Their, J. P. Epithelial-mesenchymal transitions in tumor progression. Nature Reviews Cancer (2002) doi:10.1038/nrc822.

28.           Singh, A. et al. A Gene Expression Signature Associated with ‘K-Ras Addiction’ Reveals Regulators of EMT and Tumor Cell Survival. Cancer Cell (2009) doi:10.1016/j.ccr.2009.03.022.

29.           Simon, G. R. & Turrisi, A. Management of small cell lung cancer: ACCP evidence-based clinical practice guidelines (2nd edition). Chest (2007) doi:10.1378/chest.07-1385.

30.           Usuda, J. et al. Klotho predicts good clinical outcome in patients with limited-disease small cell lung cancer who received surgery. Lung Cancer 74, 332–337 (2011).

31.           Jänne, P. A. et al. Twenty-five years of clinical research for patients with limited-stage small cell lung carcinoma in North America: Meaningful improvements in survival. Cancer (2002) doi:10.1002/cncr.10841.

32.           Pako, J. et al. Assessment of the circulating klotho protein in lung cancer patients. Pathol Oncol Res (2018) doi:10.1007/s12253-018-0441-5.