Quale anticorpo anti-Klotho usare?

 

Ogni Ricercatore nel corso della sua carriera, prima o poi, si dovrà scontrare con il dilemma riguardante quale sia il miglior kit di analisi da utilizzare per i suoi esperimenti.

Il mondo di Klotho non è esente da questo problema. Sono passati ormai più di venti anni dalla sua scoperta, ma non è stato sviluppato ancora un test con un’alta sensibilità e specificità in grado di dirci con la totale certezza se stiamo dosando esattamente e solo la proteina Klotho.

Nel 2019 è stato pubblicato l’articolo: “Alpha‐Klotho, a critical protein for lung health, is not expressed in normal lung”.¹ Xie e colleghi prendono in considerazione 5 anticorpi impiegati da diversi ricercatori negli ultimi due decenni e pubblicano dati in grado di scardinare alle basi anni e anni di pubblicazioni.

Gli anticorpi testati sono:
- Anticorpo 1 (A1): clone‐KM2076, diretto versus il dominio Kl1, MONOclonale da ratto, reperibile in commercio anche con il nome KO603 (TransGenic Inc, Fukuoka, Japan);
- Anticorpo 2 (A2): clone‐KM2119, diretto versus il dominio Kl2, MONOclonale da ratto, reperibile in commercio con il nome KO604, (TransGenic Inc, Fukuoka, Japan);
- Anticorpo 3 (A3): MAB1819 (R&D Systems), MONOclonale anti-topo da ratto (Rat monoclonal anti‐mouse);
- Anticorpo 4 (A4): ab203576 (Abcam), POLIclonale anti-topo da coniglio (Rabbit polyclonal anti‐mouse);
- Anticorpo 5 (A5): sc74205 (Santa Cruz, Dallas TX), MONOclonale anti-topo da ratto (Rat monoclonal anti‐mouse).

Per quanto riguarda l’immunoprecipitazione (IP, Immunoprecipitation) è stato impiegato un sesto anticorpo sintetico anti-Klotho, l’sb48 (anche noto in commercio come sb106).

Gli Autori, utilizzando A1 e A2, non riscontrano nessuna espressione della proteina Klotho nel polmone sano sia murino che umano. Il risultato opposto si ottiene impiegando A3, A4 e A5.

A1 e A2 hanno confermato la loro sensibilità e specificità nel determinare l’espressione di Klotho nel rene, ma anche nel polmone dopo espressione artificiale mediante tecnica apposita.

All’immunoistochimica (IHC, Immunohistochemistry) A1 e A2 non colorano nessuna struttura a differenza di A3, A4 e A5.

All’immunoblot (IB), il test è negativo con A1 e A2, mentre A3, A4 e A5 producono multiple bande non compatibili con la mobilità elettroforetica della forma completa (Kl1+Kl2, full-length Klotho).

Da ricordare che all’IB, la forma completa (Kl1+Kl2) sia transmembrana che solubile creano una banda a 130 kD,² mentre il dominio Kl1 migra tra i 65 e 70 kD.³

In uno degli studi⁴ riportati nel post Klotho e Fibrosi cistica, Krick e colleghi hanno determinato tramite IHC e IB la presenza di Klotho a livello dell’epitelio bronchiale dei pazienti. Tuttavia, Xie e colleghi mettono in discussione i risultati facendo notare che le due bande mostrate corrispondono a ~65 e ~80 kD e non invece a 130 kD tipico della forma Kl1+Kl2. Bande che sarebbero in contrasto con un altro studio⁵ di Krick effettuato su pazienti COPD (Chronic Obstructive Pulmonary Disease) nel quale, pur impiegando lo stesso anticorpo, veniva mostrata all’IB una sola banda a circa 130 kD.

Importante osservazione da parte degli Autori è la discrepanza tra il riscontro, tramite RT-PCR, della trascrizione dell’mRNA e la reale produzione della proteina Klotho. Questa assunzione è confermata citando due studi. Il primo,⁶ pubblicato da Li e colleghi, inerente alla ridotta espressione dell’mRNA di Klotho nei macrofagi alveolari dei pazienti fumatori, il secondo di Han³ nel quale non è riscontrata nessuna produzione della proteina. La discrepanza si potrebbe spiegare ipotizzando che l’RT-PCR vada ad amplificare dei trascritti dai quali, in vivo, non segua il processo di traduzione.⁷ Teoria supportata da uno studio⁸ del 2017 nel quale è stato dimostrato, nell’uomo, che dallo splicing alternativo non segue nessuna traduzione, ma che in realtà, l’mRNA vada incontro ad un processo di degradazione.

Per quanto riguarda l’IP, al momento della pubblicazione dell’articolo e impiegando A1 e A2, nessun laboratorio è in grado di rilevare alfa-Klotho in alcun tessuto compreso quello renale.

L’anticorpo sintetico sb106 (anche chiamato sb48) è stato prodotto per essere impiegato nell’IP.⁹ Tuttavia è in grado di legarsi alla sola forma non-denaturata di Klotho, determinazione che, invece, avviene anche per la forma denaturata qualora impiegassimo gli anticorpi A1 e A2  nelle metodiche IHC e IB.

Dubbi su questo anticorpo sintetico derivano dal fatto che sb106 sia da una parte certamente in grado di colorare le cellule non fissate che iperesprimono Klotho ma dall’altra parte questa caratteristica potrebbe essere spiegata proprio dalla mancanza di fissazione delle cellule stesse.⁹

Passiamo ora alla determinazione sierica della proteina Klotho.

Il test ELISA possiede una sensibilità e una specificità subottimale nel determinare la concentrazione di plasmatica/sierica di Klotho.^9,10 Lo stesso test, inoltre, non può essere impiegato per determinare la concentrazione di Klotho nei lisati derivati dai tessuti biologici.

Dall’altro canto, un precedente studio,¹¹ ha impiegato l’anticorpo A1 ed è stato in grado di determinare la concentrazione sierica di alfa-Klotho tramite le metodiche IP e IB. Ma non solo, i Ricercatori hanno anche definito la sensibilità e la specificità dell’anticorpo A1 stesso. Specifiche non sempre reperibili con facilità per gli altri anticorpi in commercio.

Un anticorpo presente in commercio, prodotto nel 2010,^12,13 e ampiamente utilizzato per determinare nell’uomo le concentrazioni plasmatiche/sieriche di Klotho ma non testato nel presente studio è quello della ImmunoBiological Laboratories (Gumna, Japan). Il codice del prodotto è #27998.

L’anticorpo si lega sia a Kl1 che a Kl1+Kl2. Il kit ELISA può essere impiegato per determinare la concentrazione di Klotho nel siero, plasma (provetta contenente EDTA, eparina o citrato) e nelle urine.

Il range di concentrazione determinabile oscilla tra un minimo di 93.75 ad un massimo di 6,000 pg/mL.

La sensibilità del test è pari a 6.15 pg/mL. Purtroppo, non è nota la specificità di questo anticorpo.

Se prendessimo in considerazione la possibilità, non del tutto escludibile nella pratica clinica e di ricerca, di effettuare dei cicli di congelamento/scongelamento (Frozen/Thaw cycles) scopriamo che per il siero, al terzo ciclo, otteniamo una riduzione solo 8% della concentrazione di Klotho rispetto al valore ottenuto se analizzassimo il campione senza effettuare nessun ciclo di congelamento/scongelamento. Il medesimo risultato, tuttavia non lo otteniamo per il dosaggio della proteina Klotho nelle urine, al terzo ciclo osserviamo un crollo di circa del 43%.

 

Da segnalare un ulteriore anticorpo impiegato per la colorazione immunoistochimica nel il cancro gastrico, e identificato con il codice AB69208 (Abcam, HK). Si tratta di un anticorpo POLIclonale da coniglio anti-Klotho umano.¹⁴

 

Concludendo:

A livello polmonare, la forma completa di Klotho non è espressa, pertanto il suo effetto citoprotettivo deriva dalla forma solubile (sKl) prodotta dal rene.

Infatti, gli Autori ipotizzano che il polmone prelevi dalla circolazione sKl e che lo processi in sede intracellulare.

Una simile circostanza si realizza anche a livello miocardico; il cuore non esprime Klotho, tuttavia si assiste ad un remodeling patologico negli stati in cui Klotho è depleto. Inoltre, il reintregro di quest’ultimo porta ad un miglioramento della cardiomiopatia.^15,16

Interessanti sarebbero gli studi che vadano a confrontate gli anticorpi (da A1 a A5) con l’anticorpo dell’IBL. In particolare, potrebbe essere utile per una trasposizione dei Dati delle Ricerche nella pratica clinica, una comparazione tra kit ELISA per definire a distanza di vent’anni quale/i sia/siano i migliori anticorpi da impiegare per dosare la concentrazione di Klotho nel siero umano.

 

Ringraziamenti:

Un doveroso ringraziamento alla Prof.ssa Connie C.W. Hsia della Southwestern Medical Center (Università del Texas, USA) per i chiarimenti forniti e alla Dott.ssa Ayano Enya della ImmunoBiological Laboratories (IBL, Gumna, Japan) per le specifiche fornite in merito al loro anticorpo #27998.

 

Se conoscete altri studi in merito fatemelo sapere, attendo vostri suggerimenti, a disposizione per dubbi e chiarimenti. Per maggiori approfondimenti specifici vi rimando alla lettura dei singoli articoli.

 

MEDLINE: effettuata su Pubmed alla data di pubblicazione del post, parole chiave della ricerca: “Alpha‐Klotho, a critical protein for lung health, is not expressed in normal lung”.

CREDITS: Photo by National Cancer Institute on Unsplash

Bibliografia:

1.             Zhang, J. et al. Alpha-Klotho, a critical protein for lung health, is not expressed in normal lung. FASEB bioAdvances 1, 675–687 (2019).

2.             Imura, A. et al. Secreted Klotho protein in sera and CSF: implication for post-translational cleavage in release of Klotho protein from cell membrane. FEBS Lett 565, 143–147 (2004).

3.             Han, X. et al. Counter-regulatory paracrine actions of FGF-23 and 1,25(OH)2D in macrophages. FEBS Lett. (2016) 

4.             Krick, S. et al. Klotho Inhibits Interleukin-8 Secretion from Cystic Fibrosis Airway Epithelia. Sci. Rep. (2017) 

5.             Krick, S. et al. Fibroblast growth factor 23 and Klotho contribute to airway inflammation. Eur. Respir. J. (2018) 

6.             Li, L. et al. Klotho reduction in alveolar macrophages contributes to cigarette smoke extract-induced inflammation in chronic obstructive pulmonary disease. J. Biol. Chem. (2015)

7.             Cooper, D. N., Berg, L. P., Kakkar, V. V. & Reiss, J. Ectopic (illegitimate) transcription: New possibilities for the analysis and diagnosis of human genetic disease. Ann. Med. (1994)

8.             Mencke, R. et al. Human alternative Klotho mRNA is a nonsense-mediated mRNA decay target inefficiently spliced in renal disease. JCI Insight 2, (2017).

9.             Barker, S. L. et al. The demonstration of alphaKlotho deficiency in human chronic kidney disease with a novel synthetic antibody. Nephrol Dial Transpl. 30, 223–233 (2015).

10.           Neyra, J. A. et al. Performance of soluble Klotho assays in clinical samples of kidney disease. Clin. Kidney J. (2019) doi:10.1093/ckj/sfz085.

11.           Ravikumar, P. et al. alpha-Klotho protects against oxidative damage in pulmonary epithelia. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 307, L566-75 (2014).

12.           Yamazaki, Y. et al. Establishment of sandwich ELISA for soluble alpha-Klotho measurement: Age-dependent change of soluble alpha-Klotho levels in healthy subjects. Biochem. Biophys. Res. Commun. (2010)

13.           IBL. Pamphlet - Human anti-Klotho antibody #27998. https://www.ibl-japan.co.jp/files/topics/1178_ext_02_en_0.pdf.

14.           He, X. J. et al. Up-regulated miR-199a-5p in gastric cancer functions as an oncogene and targets klotho. BMC Cancer 14, 218 (2014).

15.           Hu, M. C. et al. Recombinant alpha-Klotho may be prophylactic and therapeutic for acute to chronic kidney disease progression and uremic cardiomyopathy. Kidney Int 91, 1104–1114 (2017).

16.           Hu, M. C. et al. Klotho and phosphate are modulators of pathologic uremic cardiac remodeling. J Am Soc Nephrol 26, 1290–1302 (2015).